Клас на endonucleases, който разцепва ДНК след признаването определена последователност, например, Бам H1 (5´GGATCC3´), еко RI (5´GAATTC3´), както и Хин dIII (5´AAGCTT3´). Има три типа на ограничение endonuclease ензими:

тип I: разфасовки неспецифично разстояние по-голямо от 1000 bp от неговото признаване последователност и съдържа ограничение и метилирането дейности.

Тип II: Разфасовки в или близо до кратко и често palindromic (q.v.), разпознаване на последователност. A отделен ензим methylates същата последователност на признаване. Те могат да правят съкращения в двете ДНК нишки точно срещу един друг и генерират тъпи приключва, или те могат да направят разсрочени разфасовки да генерира прилепващи краища. Тип II ограничение ензими са тези-често използвани в рекомбинантна ДНК технология.

Тип III: разфасовки от 24-26 bp надолу по течението от поредица кратки, асиметрични признаване. Изисква АТФ и съдържа ограничение и метилирането дейности.